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fluorophore près de son excitation maximale. Le deuxième
faisceau STED stimule la relaxation d’énergie des fluoro-
phores depuis les états vibrationnels les plus élevés vers le
premier état excité. Les deux faisceaux superposés balayent
l’échantillon comme en microscopie confocale. La résolution
(30 –50 nm) est donnée par la taille du spot central ou les
uorophores restent excités. Le STED est compatible avec
une large gamme de sondes uorescentes incluant des
uorophores organiques et des protéines fluorescentes telles
que la GFP ou la YFP.
La double nécessité d’une puissance importante pour la
déplétion et de l’alignement précis des deux faisceaux a
fait craindre un temps que le STED soit confiné à l’image-
rie d’échantillons fixés et de faible épaisseur. En fait, diffé-
rentes améliorations techniques et le fait que le faisceau
de déplétion soit dans l’infra-rouge - une longueur d’onde
peu absorbée par les tissus cérébraux - a permis d’appli-
quer le STED sur des échantillons très variés, y compris des
tranches vivantes de cerveau, pour visualiser les épines ou
l’actine dans les épines jusqu’à plusieurs dizaines de microns
de profondeur, en conservant une résolution de l’ordre de
60 nm
(1, 6)
. Plus généralement, le STED a été largement
utilisé en neuroscience, par exemple pour l’imagerie des
vésicules synaptiques ou l’élucidation de la structure des
synapses de drosophile et même
in vivo
.
Pour l’imagerie en 3 dimensions, la forme classique en
anneau de la PSF (Point Spread Function) du STED n’offre
pas de résolution augmentée dans l’axe z, conduisant à une
forte hétérogénéité entre la résolution xy (environ 50 nm) et la
résolution z (environ 600 nm). Toutefois, une amélioration en
z peut être obtenue par la mise en forme du faisceau STED
qui impose un effet STED au-dessus et au-dessous du plan
focal. D’autres processus que l’émission stimulée permettent
également d’éteindre la fluorescence en périphérie de la
tache de fluorescence et donc atteindre la super résolution.
Un concept plus général appelé RESOLFT affirme que pra-
tiquement n’importe quel type de photo conversion permet
la microscopie super-résolution.
Microscopie par illumination structurée
En microscopie à lumière structurée (SIM), une image avec
deux fois la résolution spatiale normale est calculée à partir
de multiples images brutes
plein champs
contenant des
franges d’interférence (appelées motifs moirés) résultant
de l’éclairage de l’échantillon avec de la lumière structurée,
appliquées sur plusieurs orientations. Les images recueillies
dans les différentes phases et orientations peuvent être
traitées mathématiquement pour extraire l’information spa-
tiale sous-tendant les franges de moiré et ainsi fournir une
image haute résolution de la structure sous-jacente et une
amélioration de la résolution d’un facteur 2 (x,y 100 nm)
dans le plan focal.
Il est également possible d’améliorer la résolution axiale.
En recueillant des images SIM de plans focaux multiples
(3D-SIM) on maintient une résolution latérale d’environ 100
nm et diminue la résolution axiale à environ 300 nm, soit deux
fois mieux qu’en imagerie confocale. Pour reconstruire un
seul plan, au moins 15 images avec des patrons d’éclairage
différents sont requises, résultant en un temps d’acquisition
de plusieurs secondes à quelques minutes pour une pile
d’images 3D. Les principaux attraits du SIM, pour les appli-
cations en biologie cellulaire, sont que les fluorophores et
protocoles standards de marquage peuvent être utilisés, et
que l’imagerie 3D multicolore est possible avec une amé-
lioration isotrope de la résolution. Cependant, le SIM reste
une technique lente, gourmande en calcul et peu adaptée
à l’imagerie du vivant. En neuroscience, cette technique a
par exemple été utilisée pour suggérer que le réseau pré-
synaptique d’ankyrine relie les protéines membranaires au
cytosquelette de microtubules pour organiser et stabiliser
les terminaisons synaptiques
(3)
.
Les techniques basées sur la détection à haute densité
de molécules individuelles
Toute une famille d’approches super résolution se retrouvent
sous le vocable générique d’approches pointillistes, ou en-
core de détection stochastique de molécules individuelles.
Le principe de ces approches pour dépasser la limite de
Tableau 1
: liste non
exhaustive des principales
techniques d’imagerie
super résolution, de leurs
acronymes et résolution.
Pour une liste plus complète
voir la référence 3.
Nom de la technologie
Acronyme Résolution (nm)
T
echniques de mise
en
forme de
la
lumière
Stimulated Emission Depletion Microscopy
STED
∼
40 (x, y, z)
Reversible Saturable Optical Fluorescence Transition
RESOLFT
∼
50-100 (x, y)
Structured Illumination Microscopy
SIM
∼
100 (x, y)
3D- Structured Illumination Microscopy
3D-SIM
∼
100 (x, y)
∼
300 (z)
T
echniques
de
localisation
de molécules
individuelles
Photoactivated Localization Microscopy
PALM
∼
2-25 (x, y)
Fluorescence Photoactivated Localization Microscopy
F-PALM
∼
2-25 (x, y)
Interferometric Photoactivated Localization Microscopy
iPALM
<20 (x,y,z)
Universal Point Accumulation In Nanoscale Topography
uPAINT
∼
20-30 (x, y)
Single Particle Tracking PALM
sptPALM
<25 (x,y)
Stochastic Optical Reconstruction Microscopy
STORM
∼
20 (x, y)
Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy
dSTORM
∼
21 (x, y)
Ground State Depletion Microscopy with Individual Molecule Return GSDIM
∼
18-40 (x, y)
3D-Stochastic Optical Reconstruction Microscopy
3D-STORM
∼
20-30 (x, y) 50-60 (z)
... « le STED a été largement utilisé
en neuroscience, par exemple
pour l’imagerie des vésicules synaptiques » ...
... « le SIM reste une technique lente,
gourmande en calcul et peu adaptée
à l’imagerie du vivant. » ...
