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Quelques perspectives
La microscopie STED est longtemps restée une technologie
chère et complexe à mettre en œuvre. Les développements
récents devraient permettre une plus grande pénétration
de cette technologie dans nos laboratoires pour l’imagerie
en profondeur dans les tissus. Parce qu’elles sont basées
sur une illumination plein champ, les techniques de molé-
cules unique PALM et STORM ont été jusqu’à présent prin-
cipalement utilisées pour l’imagerie de cellules en culture
monocouche. Cependant une pénétration en profondeur
raisonnable, par exemple l’imagerie de quelques couches
de cellules au-dessous de la surface d’une tranche de cer-
veau, devrait en théorie être possible. La dynamique des
récepteurs à l’échelle nanométrique semble jouer un rôle
fondamental dans la plasticité synaptique à court terme
(10)
.
Il apparaît que nous sommes à l’aube de l’utilisation de ces
approches et l’on peut, prédire, sans risque, que l’avenir
des technologies de super résolution est lumineux pour les
neurosciences et la compréhension de la nano-physiologie
synaptique.
R
éférences
(1) Sigrist, S.J. & Sabatini, B.L. Optical super-resolution microscopy in
neurobiology. Curr Opin Neurobiol 22, 86-93 (2012).
(2) Dani, A. & Huang, B. New resolving power for light microscopy: applications
to neurobiology. Curr Opin Neurobiol 20, 648-652 (2010).
(3) Patterson, G.H. Fluorescence microscopy below the diffraction limit.
Semin Cell Dev Biol 20, 886-893 (2009).
(4) Hell, S.W. Far-field optical nanoscopy. Science 316, 1153-1158 (2007).
(5) Giannone, G., et al. Dynamic superresolution imaging of endogenous
proteins on living cells at ultra-high density. Biophysical journal 99, 1303-
1310 (2010).
(6) Urban, N.T., Willig, K.I., Hell, S.W. & Nagerl, U.V. STED nanoscopy of actin
dynamics in synapses deep inside living brain slices. Biophysical journal
101, 1277-1284 (2011).
(7) Hoze, N., et al. Heterogeneity of AMPA receptor trafficking and molecular
interactions revealed by superresolution analysis of live cell imaging.
PNAS 109, 17052-17057 (2012).
(8) Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C. & Zhuang, X. Superresolution
imaging of chemical synapses in the brain. Neuron 68, 843-856 (2010).
(9) Izeddin, I., et al. Wavelet analysis for single molecule localization
microscopy. Opt Express 20, 2081-2095 (2012).
(10)Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic
transmission. Science 320, 201-205 (2008).
cylindrique pour déformer la PSF de la fluorescence d’une
molécule dans les directions latérales selon sa position dans
le plan focal. Le PALM interférométrique (iPALM) utilise 2
objectifs juxtaposés pour recombiner l’émission de chaque
molécule et utiliser les interférences ainsi créées en fonction
de leur position par rapport au plan focal pour déterminer
leur position axiale.
Nous avons développé une variante de ces approches qui
utilise la diffusion de ligands fluorescents dans le milieu
extracellulaire de cellules en culture et leur liaison aléatoire
à leurs cibles à la surface des cellules illuminées par un fais-
ceau oblique pour les faire basculer entre un état noir et un
état brillant quand elles diffusent dans le pinceau lumineux
(uPAINT)
(5).
Cette technique présente l’avantage de pouvoir
être utilisée sur cellule vivante pour marquer les protéines
endogènes exprimées à la surface cellulaire. Le PALM et le
uPAINT permettent également d’obtenir la carte des mouve-
ments des molécules à haute densité en combinant localisa-
tion et suivi de particule (sptPALM). En neuroscience, le PALM
a été utilisé pour analyser la distribution et la dynamique de
l’actine dans les épines. Nous avons utilisé cette approche
pour identifier la distribution de récepteurs du glutamate et
leur mobilité sur les neurones d’hippocampe, mettant en
évidence une organisation en agrégats sub-micrométrique
des récepteurs AMPA7. Le STORM 3 couleurs 3D a été utilisé
pour cartographier l’organisation de protéines synaptiques
(8)
, indiquant les relations spatiales de 10 protéines pré et
post synaptiques.
Le concept de base et la mise en œuvre des techniques
pointillistes sont assez simples, mais une lourde analyse est
nécessaire pour produire des images super résolues puisque
plusieurs dizaines de milliers d’images contenant chacune
plusieurs centaines de molécules doivent être analysées.
Alors que la résolution temporelle de ces techniques était
au départ assez faible, les progrès des uorophores et des
algorithmes de traitement d’image ont réduit notablement le
temps d’acquisition et de traitement des images à quelques
secondes
(9)
, améliorant ainsi les performance pour l’ima-
gerie dynamiques des événements cellulaires.
Figure 2 : images en super résolution de trajectoires et
localisations de récepteurs AMPA individuels, obtenues par
sptPALM.
Haut
: accumulation sur un dendrite épineux de trajectoires de milliers
de récepteurs AMPA individuels, obtenues par imagerie sptPALM de
la sous unité GluA1 étiquetée avec la protéine photo-convertible EOS
exprimée dans un neurone d’hippocampe vivant en culture primaire.
Bas
- colonne de gauche : exemples d’images basse résolution en
fluorescence plein champ de trois épines dendritiques.
Colonne du milieu : images super résolues des mêmes épines obtenues
par accumulation de localisation de molécules individuelles.
Colonne de droite : superposition des trajectoires des récepteurs
individuels sur ces épines.
Images obtenues par D. Nair, E. Hosy, J.-B. Sibarita et D. Choquet,
Institut Interdisciplinaire de Neuroscience, UMR 5297 CNRS-
Université de Bordeaux.
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analyser la distribution et la dynamique de
l’actine dans les épines »...
