La lettre
n°44
ouveautés en neurosciences
Figure 1 : schémas descriptifs des principales
techniques d’imagerie super résolution
A
: principe de la limite de diffraction. L’image d’un point source
est une tache de diffraction appelée disque d’Airy et de diamètre
approximativement égal à la longueur d’onde.
Deux points sources ne peuvent être distingués que s’ils sont
séparés d’une distance supérieure à la moitié de la longueur
d’onde (critère de Raleigh).
B
: principe de l’émission stimulée,
à la base de la microscopie STED.
C
: principe de l’illumination
structurée.
D
: principe de l’obtention d’images super résolues
par accumulation de localisation de molécules individuelles,
à la base des approches PALM et STORM. E : principe de la
technique de U-PAINT. Voir texte pour les détails.
diffraction est d’utiliser des conditions d’observation telles
qu’à un instant donné des fluorophores individuels allumés
aléatoirement peuvent être détectés et localisés avec une
précision meilleure que la limite de diffraction. Puis le pro-
cessus est répété itérativement un grand nombre de fois
pour reconstruire une image globale de l’échantillon - d’où
le terme de pointillisme.
Ces approches s’avèrent extrêmement puissantes et effi-
caces pour analyser l’architecture moléculaire des structures
subcellulaires dans des échantillons de tissus. Elles com-
binent en effet une excellente résolution tridimensionnelle
(pouvant atteindre environ 10 nm en XY et environ 50 nm en
Z), une très bonne compatibilité avec le vivant pour certaines
et une grande aisance à effectuer de l’imagerie multi couleur.
Dans la plupart des approches de microscopie convention-
nelle, les fluorophores sont trop denses pour être résolus indi-
viduellement. En microscopie de localisation, un petit sous-
ensemble de molécules uorescentes sont successivement
activées et visualisées à l’aide d’une caméra sensible. Si la
fraction de fluorophores activés est maintenue suffisamment
basse telle que la distance inter- uorophores est grande
par rapport à la résolution conventionnelle du microscope,
la localisation spatiale de chaque uorophore individuel
allumé peut être calculée avec une grande précision à partir
du centre de masse de la tache de fluorescence, qui est
une figure de diffraction. La précision de pointé de cette
localisation est en première approximation proportionnelle
à la racine carrée du nombre de photons détectés. L’image
finale est construite d’une manière cumulative en additionnant
toutes les localisations des molécules (revues dans1-4).
Il existe une grande variété d’approches pointilliste. Pour per-
mettre l’activation stochastique des molécules uorescentes
individuelles, le PALM et le STORM font respectivement usage
de protéines uorescentes photo-activables ou de paires
de colorants cyanine photoconvertibles qui sont imagées
séquentiellement pendant leur alternance entre les états bril-
lants et noirs. Il existe plusieurs variantes de ces méthodes.
Le GSDIM ou dSTORM sont des variantes du STORM uti-
lisant des flurophores organiques dont l’état fondamental
est déplété en faveur d’un état triplet par une illumination
intense en absence d’oxygène de manière à éviter leur pho-
to-blanchiment. Le retour stochastique à l’état fondamental
permet la détection aléatoire de molécules individuelles.
Le PALM est particulièrement adapté aux mesures sur
cellules vivantes car les protéines fluorescentes utilisées
nécessitent une faible intensité lumineuse pour leur pho-
toconversion. Le PALM étant basé sur la détection d’une
fusion génétique d’une protéine photoconvertible à une pro-
téine d’intérêt, il présente également l’avantage de révéler
l’ensemble des cibles. L’utilisation des variantes du STORM
est par contre généralement limitée aux cellules fixées du
fait d’une part, de la nécessité d’enlever l’oxygène et d’autre
part, d’illuminer fortement l’échantillon (bien que l’utilisation
du dSTORM en cellule vivante ait été rapportée). Le STORM
et les techniques associées reposent par ailleurs sur un mar-
quage exogène - généralement par immunohistochimie - avec
les limitations d’accessibilité des antigènes et de spécificité
associées à ces approches.
Ces techniques permettent d’atteindre facilement de très
bonnes résolutions latérales (environ 10-30 nm), mais l’ob-
tention d’une amélioration de la résolution axiale exige des
adaptations. Par exemple, le 3D-STORM utilise une lentille
... « Le PALM est particulièrement adapté aux
mesures sur cellules vivantes »...
